Qiagen12866-25強(qiáng)力土壤總RNA提取試劑盒
力土壤總RNA提取試劑盒.jpg)
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名稱
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品牌
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貨號(hào)
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規(guī)格
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保存
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強(qiáng)力土壤總RNA提取試劑盒
RNeasy PowerSoil Total RNA Kit
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QIAGEN
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12866-25
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kit
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室溫保存
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產(chǎn)品介紹
QIAGEN RNeasy PowerSoil總RNA套件專為從土壤中的生物體中提取總RNA而設(shè)計(jì)，能夠可靠地提供用于定性和定量RT-PCR分析的RNA。該套件能有效去除土壤中提取的RNA中的腐殖質(zhì)、富里酸及其他RT-PCR抑制劑。無(wú)論是堆肥、糞便、河口沉積物還是其他富含有機(jī)物的土壤類型，使用此套件都能成功提取出完整且適合RT-PCR擴(kuò)增的RNA。
LifeGuard土壤保存溶液是一種專為RNA提取的土壤收集和運(yùn)輸設(shè)計(jì)的處理方案。該溶液能夠保護(hù)土壤中的細(xì)菌活性，同時(shí)保持它們處于休眠狀態(tài)。它能有效防止RNase和DNase的活性，確保在野外采集的樣本上進(jìn)行準(zhǔn)確、全長(zhǎng)cDNA合成及16S rRNA譜型分析。使用LifeGuard溶液穩(wěn)定后的土壤，其微生物群落的特征可以在-20°C下維持長(zhǎng)達(dá)30天，在4°C下維持1周，在室溫下維持3天。
我們不推薦使用RNALater和RNAProtect保存土壤中的核酸。
對(duì)于最多2克的土壤樣本，均質(zhì)化過(guò)程在含有碳化硅珠、裂解緩沖液、苯酚/氯仿/isoamyl alcohol（pH 6.5-8）和溶液IRS的15毫升試管中進(jìn)行，以確保所有微生物完全裂解并中和RNase。裂解后的樣品通過(guò)沉淀濃縮總核酸，沉淀物再懸浮于優(yōu)化的緩沖液中，該緩沖液適用于陰離子交換重力流柱。RNA使用高鹽緩沖液洗脫后再次沉淀，最終純化的RNA重新懸浮于無(wú)
RNase的水中。如果需要，可以使用RNeasy PowerSoil DNA洗脫試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)12867-25）從RNA中單獨(dú)純化DNA。分離出的核酸已準(zhǔn)備好用于酶促應(yīng)用。
產(chǎn)品特征
◆通過(guò)從多達(dá) 2 克土壤中純化 RNA，從生物質(zhì)樣品中獲得高 RNA 產(chǎn)量
◆從所有土壤樣品類型（包括困難的環(huán)境樣品）中分離出高質(zhì)量的 RNA
◆輕松去除 PCR 抑制劑，獲得高純度 RNA，可直接用于下游應(yīng)用
產(chǎn)品規(guī)格
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特征
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規(guī)格
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每次運(yùn)行或每次制備的時(shí)間
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2.5 小時(shí)
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樣本量
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2 克
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吞吐量
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1-4 個(gè)樣品
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樣品類型
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所有土壤樣品，包括堆肥、沉積物和糞便
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加工
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胎圈打磨
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格式
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陰離子交換柱
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Kit Contents
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RNeasy PowerSoil Total RNA Kit
Catalog no.
Number of preps
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(25)
12866-25
25
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PowerBead Tubes, Carbide
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25
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PowerBead Solution
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2 x 42 ml
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Solution SR1
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7 ml
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Solution IRS
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2 x 15 ml
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Solution SR3
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42 ml
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Solution SR4
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6 x 27.5 ml
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Solution SR5
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110 ml
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Solution SR6
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28 ml
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Solution SR7
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2 x 1.5 ml
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JetStar 2.0 Mini Columns
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25
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Collection Tubes (2.2 ml)
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25
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Collection Tubes (15 ml)
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2 x 50
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Quick Start Protocol
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1
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用戶需提供的設(shè)備和試劑
在處理化學(xué)品時(shí)，應(yīng)始終穿戴合適的實(shí)驗(yàn)服、一次性手套和護(hù)目鏡。如需更多信息，請(qǐng)查閱產(chǎn)品供應(yīng)商提供的適當(dāng)安全數(shù)據(jù)表（SDS）。
●可離心15 ml試管的離心機(jī)（最低2500 x g）
●Microcentrifuge (13,000 x g)
●Pipettors (20 μl–1000 μl)
●血清學(xué)移液管（1 ml和10 ml）
●旋渦精靈®2旋渦
●旋渦管接頭，用于4（15 ml）試管（目錄號(hào)13000-V1-15)
●無(wú)RNase手套（產(chǎn)品目錄號(hào)：1556-S、1556-M和1556-L)
●用于RNase去除的實(shí)驗(yàn)室清潔劑（產(chǎn)品編號(hào)：12095-500)
●苯酚/氯仿/isoamyl alcohol溶液
●熱阻塊設(shè)定為45°C（可選）
方案：有經(jīng)驗(yàn)的用戶
開始前的重要事項(xiàng)
●如果溶液IRS已沉淀，加熱至60°C直至沉淀物溶解。
●在室溫（15-25°C）下進(jìn)行所有離心步驟。
●始終佩戴無(wú)RNase手套，并從工作區(qū)域清除RNase。
程序
1. 向15 ml PowerBead管（提供）中加入最多2g土壤。有關(guān)處理的土壤量的信息，請(qǐng)參閱故障排除指南。
2. 加入2.5 ml PowerBead溶液、0.25 ml溶液SR1和0.8 ml溶液IRS。
3. 加入3.5 mL苯酚/氯仿/isoamyl alcohol(pH 6.5-8.0，[用戶自備]）。蓋上蓋子并渦旋振蕩PowerBead管，直至兩相層消失。
4. 將PowerBead管置于渦旋混合器適配器（產(chǎn)品目錄號(hào)13000-V1-15)上，并以******速度渦旋15分鐘。
5. 取出PowerBead管，以2500 x g離心10分鐘。
6. 將上層水相（避開界面和下層酚層）轉(zhuǎn)移至提供的15毫升干凈收集管中。丟棄酚/氯仿/isoamyl alcohol混合物。注意：在有機(jī)質(zhì)含量高的土壤中，兩相層會(huì)變得厚實(shí)且堅(jiān)固，可能需要刺穿以去除底部的酚層。
7. 添加1。向水相中加入5毫升溶液SR3并渦旋混合。在2-8°C條件下孵育10分鐘，隨后在室溫下以2,500 x g離心10分鐘。
8. 轉(zhuǎn)移上清液至新的15 mL收集管（提供），同時(shí)避免擾動(dòng)沉淀物（如有）。
9. 向收集管中的上清液中加入5 mL溶液SR4，顛倒或渦旋混勻。在室溫下孵育30分鐘。
注：之前方案的說(shuō)明是在-20°C下培養(yǎng)。如果您使用之前的方案對(duì)您的土壤類型獲得了
良好的結(jié)果，您可以繼續(xù)遵循該方案。
10. 以2500 x g離心30分鐘。
11. 傾析上清液，并將15 ml收集管在紙巾上倒置5分鐘。
12. 搖勻溶液SR5，混合后向15 mL收集管中加入1 mL。通過(guò)反復(fù)吸打或渦旋使沉淀物完全重新懸浮。
注：如果難以重新懸浮沉淀物，將試管置于45°C的熱塊或水浴中10分鐘，隨后進(jìn)行渦旋。重復(fù)此操作直至沉淀物重新懸浮。
13. 為每個(gè)RNA分離樣品準(zhǔn)備一個(gè)JetStar Mini柱（已提供）：
13a.拆下15 ml收集管（已提供）的蓋子，將JetStar Mini柱放入其中。該柱將懸掛在收集管內(nèi)。
13b.向JetStar Mini色譜柱中加入2 mL溶液SR5。使其完全通過(guò)色譜柱重力流動(dòng)，并收集在15 mL收集管中。
注：在加載RNA分離樣品前，不要讓色譜柱干燥。
14. 將第12步的RNA分離樣品加入到JetStar Mini柱中，使其通過(guò)柱子重力流入15 ml收集管中。
15. 向JetStar Mini色譜柱中加入1 mL溶液SR5，使其完全重力流入15 mL收集管。
16. 將JetStar Mini柱轉(zhuǎn)移至新提供的15 ml收集管中。搖勻溶液SR6以混合，然后向JetStar Mini柱中加入1 ml溶液以洗脫結(jié)合的RNA。讓溶液SR6通過(guò)重力流入15 ml收集管中。
17. 將洗脫的RNA轉(zhuǎn)移至提供的2.2毫升收集管中。加入1毫升SR4溶液，充分混勻后，在-15°C至-30°C條件下孵育至少10分鐘。
18. 以13,000 x g離心2.2 ml收集管15分鐘，使RNA沉淀。
19. 傾倒上清液，將2.2 ml收集管倒置在紙巾上將顆粒風(fēng)干10分鐘。
20. 將RNA沉淀物重新懸浮于100微升的溶液SR7中。
方案：詳細(xì)
開始前的重要事項(xiàng)
●如果溶液IRS已沉淀，加熱至60°C直至沉淀物溶解。
●在室溫（15-25°C）下進(jìn)行所有離心步驟。
●始終佩戴無(wú)RNase手套，并從工作區(qū)域清除RNase。
程序
1. 向15 ml PowerBead管（提供）中加入最多2g土壤。有關(guān)處理的土壤量的信息，請(qǐng)參閱故障排除指南。
2. 加入2.5毫升PowerBead溶液、0.25毫升SR1溶液和0.8毫升IRS溶液。注意：PowerBead溶液是一種緩沖液，用于分散細(xì)胞和土壤顆粒。SR1溶液含有SDS和其他破壞劑，有助于細(xì)胞完全裂解。此外，SDS是一種陰離子洗滌劑，能夠分解多種生物細(xì)胞膜上的脂肪酸和脂質(zhì)。IRS溶液是一種沉淀試劑，可以去除非DNA的有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)，包括細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)。
注：如果溶液變冷，SR1溶液將形成白色沉淀。加熱至60℃可溶解SDS且不會(huì)對(duì)其他破壞劑造成損害。
3. 加入3.5 mL苯酚/氯仿/isoamyl alcohol(pH 6。5–8.0，[用戶自供]）。蓋上蓋子并振蕩PowerBead管，直至兩相層消失。
注：苯酚/氯仿/isoamyl alcohol可******限度提高裂解效率和產(chǎn)量。裂解后的細(xì)胞成分被溶劑捕獲，蛋白質(zhì)變性，核酸留在溶液中。
4. 將PowerBead管置于渦旋適配器（產(chǎn)品目錄號(hào)13000-V1-15)上，并以******速度渦旋15分鐘。
注：細(xì)胞通過(guò)第1至3步的化學(xué)試劑組合及渦旋產(chǎn)生的機(jī)械搖動(dòng)進(jìn)行裂解。使用渦旋適配器可******化均質(zhì)化效果，從而提高DNA產(chǎn)量。不建議使用膠帶固定試管。
5. 取出PowerBead管，以2500 x g離心10分鐘。
注：離心會(huì)導(dǎo)致樣品混合物的相分離。離心后可見三個(gè)相：下層有機(jī)相含有蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片，中間相含有腐殖質(zhì)和其他有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)，上層水相含有總核酸。
注：界面的厚度將取決于樣品類型。有機(jī)物含量高的樣品將具有較厚的界面。
6. 將上層水相（避免接觸中間相和下層酚層）轉(zhuǎn)移到提供的15毫升干凈收集管中。丟棄酚/氯仿/isoamyl alcohol混合物。注意：在有機(jī)物含量高的土壤中，兩相層會(huì)變得厚實(shí)且堅(jiān)固，可能需要刺穿以去除底部的酚層。將含有樣本總核酸的上層水相轉(zhuǎn)移至新的試管中。細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)會(huì)被留在原地。操作時(shí)要小心，避免將下層或中間相的物質(zhì)轉(zhuǎn)移過(guò)來(lái)。
7. 向水相中加入1.5 mL溶液SR3并渦旋混勻。在2-8°C下孵育10分鐘，然后在室溫下以2,500 x g離心10分鐘。
注：溶液SR3是進(jìn)一步去除蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片的二次沉淀步驟。
8. 轉(zhuǎn)移上清液至新的15 mL收集管（提供），同時(shí)避免擾動(dòng)沉淀物（如有）。
注：將含有核酸的上清液轉(zhuǎn)移至新的15 ml試管中。留下非核酸材料。
9. 向收集管中的上清液中加入5 mL溶液SR4，顛倒或渦旋混勻。在室溫下孵育30分鐘。
注：之前方案的說(shuō)明是在-20°C下培養(yǎng)。如果您使用之前的方案對(duì)您的土壤類型獲得了良好的結(jié)果，您可以繼續(xù)遵循該方案。
10. 以2500 x g離心30分鐘。
11.傾倒上清液，并將15 ml收集管在紙巾上翻轉(zhuǎn)5分鐘。注意：溶液SR4為100%異丙醇。核酸沉淀，棄去異丙醇。
12. 搖勻溶液SR5，混合后向15 mL收集管中加入1 mL。通過(guò)反復(fù)吸打或渦旋使沉淀物完全重新懸浮。
注：如果難以重新懸浮沉淀物，將試管置于45°C的熱塊或水浴中10分鐘，隨后進(jìn)行渦旋。重復(fù)此操作直至沉淀物重新懸浮。
溶液SR5是一種專有的鹽溶液，用于重新懸浮第11步中沉淀的核酸。它還用于在第13步中平衡JetStar Mini柱，并在第15步中清洗和制備該柱以進(jìn)行RNA洗脫。
13. 為每個(gè)RNA分離樣品準(zhǔn)備一個(gè)JetStar Mini柱（已提供）：
13a.拆下15 ml收集管（已提供）的蓋子，將JetStar Mini柱放入其中。該柱將懸掛在收集管內(nèi)。
13b.向JetStar Mini色譜柱中加入2 mL溶液SR5，使其完全通過(guò)色譜柱重力流動(dòng)，并收集至15 mL收集管中。
注：在加載RNA分離樣品前，不要讓色譜柱干燥。
14. 將第12步的RNA分離樣品加入到JetStar Mini柱中，使其通過(guò)柱子重力流入15 ml收集管中。
15. 向JetStar Mini色譜柱中加入1 mL溶液SR5，使其完全重力流入15 mL收集管。
注：將樣品加入到JetStar Mini柱中，核酸與柱基質(zhì)結(jié)合。然后用第二體積的溶液SR5對(duì)捕獲柱進(jìn)行洗滌，以確保在洗脫RNA之前，未結(jié)合的污染物已從樣品和柱中去除。
16. 將JetStar Mini柱轉(zhuǎn)移至新提供的15 ml收集管中。搖勻溶液SR6以混合，然后向JetStar Mini柱中加入1 ml溶液以洗脫結(jié)合的RNA。讓溶液SR6通過(guò)重力流入15 ml收集管中。
注：溶液SR6是一種專有的鹽溶液，可優(yōu)先釋放JetStar Mini柱中的RNA，而將DNA、殘留碎片和抑制物質(zhì)保留在柱中。
17. 將洗脫的RNA轉(zhuǎn)移至提供的2.2毫升收集管中。加入1毫升SR4溶液，至少搖晃一次以混合均勻，并在-15°C至-30°C的溫度下孵育至少10分鐘。
18. 以13,000 x g離心2.2 ml收集管15分鐘，使RNA沉淀。
19. 傾析上清液，將2.2 ml收集管倒置在紙巾上10分鐘，使沉淀物風(fēng)干。
注：溶液SR4為100%異丙醇。從捕獲柱洗脫的RNA沉淀、離心并允許其自然干燥，然后重新懸浮和濃縮。
20. 將RNA沉淀物重新懸浮于100微升的溶液SR7中。此時(shí)，RNA已準(zhǔn)備好用于后續(xù)應(yīng)用。
注：溶液SR7是用于重新懸浮沉淀RNA的無(wú)RNase/DNase水。溶液SR7不含EDTA。對(duì)于樣品的長(zhǎng)期儲(chǔ)存，可使用10 mM Tris（pH 8.0）或TE緩沖液重新懸浮沉淀的RNA。
方案：LifeGuard土壤保持溶液
程序
1. 每1克土壤中加入2至2.5體積的LifeGuard土壤保存液。若直接在RNeasy PowerSoil15毫升PowerBead管中收集土壤，則需向2克土壤中添加5毫升LifeGuard土壤保存液。
注：如果使用的是沉積物樣品，每克濕樣品重量應(yīng)使用3體積的LifeGuard土壤保存溶液。
2. 渦旋或手動(dòng)混合溶液和土壤，直到整個(gè)樣本被溶液浸透。多余的LifeGuard溶液應(yīng)覆蓋在土壤樣本上。
3. 在室溫（2-8°C）或-20°C條件下儲(chǔ)存。當(dāng)準(zhǔn)備處理RNA時(shí)，以2500 x g離心5分鐘以收集土壤。從試管中移除LifeGuard溶液。
4. 如果您直接在RNeasy PowerSoil 15 ml PowerBead管中收集土壤，則離心后可去除LifeGuard溶液，并繼續(xù)執(zhí)行RNeasy PowerSoil總RNA分離試劑盒方案的第2步。
5. 如果在另一個(gè)容器中穩(wěn)定了土壤，請(qǐng)稱量所需的土壤量，轉(zhuǎn)移至RNeasy PowerSoil 15ml PowerBead管或錐形管中，然后離心以去除LifeGuard溶液。
注：使用LifeGuard對(duì)幾種不同土壤進(jìn)行了測(cè)試，每種土壤的生物量和含水量各不相同。由于試劑稀釋，沉積物樣品需要更高體積的LifeGuard（3：1）。
注意：生物質(zhì)含量可能在不同溫度下穩(wěn)定土壤，并影響LifeGuard凍結(jié)群落剖面的能力。對(duì)于微生物含量未知或溫度可能超過(guò)室溫（22-25°C）的土壤，建議將其儲(chǔ)存在-20°C或2-8°C的環(huán)境中，以確保群落剖面的原始狀態(tài)，并且每克土壤使用超過(guò)2.5毫升的LifeGuard。對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存和運(yùn)輸（超過(guò)30天），應(yīng)將穩(wěn)定的土壤儲(chǔ)存在-15°C至-30°C的環(huán)境中。
故障排除指南
本故障排除指南可能有助于解決可能出現(xiàn)的任何問(wèn)題。如需更多信息，請(qǐng)參閱我們技術(shù)支
持中心的常見問(wèn)題頁(yè)面：www.qiagen.com/FAQ/FAQList.aspx。QIAGEN技術(shù)服務(wù)部的
科學(xué)家們隨時(shí)準(zhǔn)備解答您關(guān)于本手冊(cè)中的信息和/或協(xié)議，以及樣本和檢測(cè)技術(shù)的任何疑問(wèn)
（如需聯(lián)系信息，請(qǐng)?jiān)L問(wèn)www.qiagen.com)。
意見和建議
土壤處理
a) 需處理的土方量
可使用RNeasy PowerSoil總RNA試劑盒處理多達(dá)大多數(shù)土壤類型為2克。如需了解使用更大樣本量的建議，請(qǐng)聯(lián)系技術(shù)支持部門獲取建議。對(duì)于有機(jī)物含量較高的土壤，通常1克土壤即可提供足夠的RNA，同時(shí)減少純化過(guò)程中DNA殘留的可能性。對(duì)于沉積物樣本，可以使用更多的土壤。我們?cè)褂肦Neasy PowerSoil TotalRNA Kit提取高達(dá)5克的沉積物樣本。您可以在步驟9中增加溶液SR4的體積，使其與裂解液的體積相等。
b) 處理不同類型的土壤
RNA的產(chǎn)量和純度將取決于處理的土壤類型。RNeasy PowerSoil總RNA試劑盒已通過(guò)多種具有廣泛物理、化學(xué)和生物特性的土壤類型驗(yàn)證。某些土壤和沉積物可能含有過(guò)量的鹽分。這在第10步后通過(guò)一個(gè)大的白色或黃
色鹽粒來(lái)體現(xiàn)。這種鹽?？赡軙?huì)導(dǎo)致核酸產(chǎn)量減少。如果你有富含鹽分的土壤或沉積物，為了防止在加入SR4溶液后鹽粒沉淀，應(yīng)將樣品在室溫下孵育30分鐘，而不是-20°C。按照方案的其他步驟進(jìn)行操作。
程序
a) 苯酚、氯仿、isoamyl alcohol的相分離
為了確保酚/氯仿/isoamyl alcohol與水相的有效分離，需在室溫下以2500 x g的離心力對(duì)15毫升試管進(jìn)行至少10分鐘的離心（步驟5）。離心后，酚/氯仿/isoamyl alcohol層與水層之間的界面厚度會(huì)因土壤中的有機(jī)物含量不同而有所變化。在去除上層水相時(shí)，應(yīng)小心避免接觸下層酚相和中間相。該溶液含有蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。如果移除部分酚層或界面，可以重新離心轉(zhuǎn)移的含水相試管，以獲得僅能去除水相的相分離?；蛘?，可以向受酚或界面污染的含水相中加入等體積（2毫升）的氯仿，倒置或渦旋混合，然后在室溫下以2500 x g離心10分鐘。移除上層水相，丟棄下層的氯仿/酚界面。然后將剩余的水相與之混合，并繼續(xù)按照協(xié)議操作。
b) 溶液SR5中的顆粒再懸浮
有機(jī)含量高的土壤類型可能會(huì)產(chǎn)生難以重新懸浮的RNA沉淀。將RNA沉淀在溶液SR5中加熱至45°C，有助于其重新懸浮。使用移液槍頭破壞RNA沉淀并劇烈渦旋，同樣有助于RNA的重新懸浮。在第14步將沉淀物應(yīng)用于柱子之前，確保完全重新懸浮沉淀物非常重要。如果不能完全重新懸浮RNA沉淀，則會(huì)導(dǎo)致RNA通過(guò)減少的柱結(jié)合而損失，并且會(huì)導(dǎo)致柱流速降低。
c) 柱流
JetStar Mini Columns適用于重力流動(dòng)，不應(yīng)與離心或真空力一起使用?？梢允褂?毫升注射器筒對(duì)柱子施加額外的正壓。將5毫升注射器筒緊貼在JetStar MiniColumns的頂部，并輕輕推動(dòng)注射器，使空氣通過(guò)柱子。流速不得超過(guò)每秒1滴。
d) RNA的DNA污染
DNA的殘留通常不會(huì)出現(xiàn)在大多數(shù)土壤類型中。然而，某些富含有機(jī)物的土壤可能會(huì)出現(xiàn)特殊的殘留情況。可以通過(guò)瓊脂糖凝膠分析或使用合格引物對(duì)分離的RNA進(jìn)行PCR來(lái)檢測(cè)純化RNA中的潛在DNA殘留，而無(wú)需先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。如果瓊脂糖電泳未檢測(cè)到擴(kuò)增片段，則表明沒(méi)有可檢測(cè)的殘留DNA。如果檢測(cè)到了DNA，建議對(duì)分離的RNA進(jìn)行DNase處理。
為了從RNA制備物中去除基因組DNA，我們推薦使用DNase Max。® 試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)15200-50)。DNase Max試劑盒采用高速DNase酶，該酶在消化后通過(guò)樹脂高效去除，樹脂可使酶失活并與其結(jié)合。RNA從DNA中純化，無(wú)需使
用抑制劑（如EDTA）或加熱處理，即可直接使用。
e) 來(lái)自同一色譜柱的多個(gè)洗脫液
使用JetStar Mini Columns時(shí)，不建議進(jìn)行超出協(xié)議要求的多次洗脫。雖然使用RNeasy PowerSoil DNA Elution Kit（產(chǎn)品編號(hào)12867-25)時(shí)，可能會(huì)有少量額外的RNA或DNA從柱子上洗脫下來(lái)，但這些物質(zhì)中的抑制劑也會(huì)開始從柱子上被洗脫下來(lái)，可能會(huì)影響后續(xù)的應(yīng)用。
附錄A：使用苯酚/氯仿/isoamyl alcohol
苯酚和氯仿有毒，可能對(duì)您的健康和安全造成危害。在使用這些化合物前，請(qǐng)務(wù)必閱讀所有制造商的警告和注意事項(xiàng)。
苯酚和苯酚/氯仿/isoamyl alcohol容易發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致它們變成黃色或粉紅色，這表明苯酚已不適合用于RNA提取。使用有色的苯酚或有色的苯酚/氯仿/isoamyl alcohol會(huì)降低RNA提取的質(zhì)量。每次使用前，應(yīng)取樣檢查。
苯酚/氯仿/isoamyl alcohol應(yīng)置于透明容器中，以觀察其澄清度和顏色。不使用時(shí)，需密封瓶蓋，并在2°-8°C的陰涼環(huán)境中儲(chǔ)存。避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光照下。
制備苯酚/氯仿/isoamyl alcohol溶液
將25份苯酚、24份氯仿和1份isoamyl alcohol混合。此溶液可在TE緩沖液（10 mM Tris，1 mMEDTA，pH 8.0)或0.1 M Tris（pH 8.0)中儲(chǔ)存，溫度控制在2°–8°C，最長(zhǎng)可達(dá)3個(gè)月。儲(chǔ)存時(shí)請(qǐng)置于棕色瓶中以避免光照。如果在TE緩沖液中儲(chǔ)存，我們建議您添加少量Tris緩沖液。
注意：氯仿與苯酚混合，以減少DNA和RNA在苯酚/水界面的損失，從而提高核酸提取的效率。氯仿能使蛋白質(zhì)變性，并有助于去除脂質(zhì)；isoamyl alcohol則能減少提取過(guò)程中的泡沫產(chǎn)生，同時(shí)有助于水相和有機(jī)相的分離。
附錄B：從JetStar Mini柱中分離DNA
從JetStar Mini Columns洗脫RNA后，也可使用RNeasy PowerSoil DNA Elution Kit（貨號(hào)：12867-25)從同一柱中洗脫DNA。該試劑盒提供了DNA分離所需的所有材料。
開始前的重要事項(xiàng)
●始終佩戴不含RNase和DNase的手套。
●開始前，從工作臺(tái)面清除RNase和DNase。
程序
1. 將RNeasy PowerSoil總RNA試劑盒第16步的JetStar Mini柱轉(zhuǎn)移至15 ml收集管（提供）中。
2. 向JetStar Mini柱中加入1 mL溶液SR8，將結(jié)合的DNA洗脫至15 ml收集管。使溶液SR8重力流入收集管中。
3. 將洗脫的DNA轉(zhuǎn)移至提供的2.2毫升收集管中，并加入1毫升溶液SR4。充分振蕩至少一次以確?；旌暇鶆?，然后在-15°C至-30°C的溫度下孵育10分鐘。
4. 在室溫下以13,000 x g離心2.2 ml收集管15分鐘，使DNA沉淀。
5. 傾析上清液，將2.2 mL收集管倒置在紙巾上10分鐘，使DNA沉淀風(fēng)干。
6. 將DNA沉淀物重新懸浮于100微升溶液SR7中。
注：雖然大多數(shù)土壤類型不會(huì)出現(xiàn)RNA殘留，但某些有機(jī)物含量高的土壤可能會(huì)出現(xiàn)獨(dú)特的殘留情況。當(dāng)RNA污染的缺失是關(guān)鍵時(shí)，建議對(duì)分離的DNA進(jìn)行RNase處理；請(qǐng)參閱手冊(cè)中的故障排除指南獲取說(shuō)明。
儲(chǔ)存；儲(chǔ)備
RNeasy PowerSoil 總 RNA 試劑盒試劑和成分應(yīng)儲(chǔ)存在室溫（15-25攝氏度）下。
北京
